Le diagnostic microbiologique
I. Généralités
Le diagnostic microbiologique a pour objet l’identification de l’agent bactérien ou viral responsable d’un processus infectieux. Pour satisfaire aux besoins du clinicien qui a en charge le malade, il faut en plus que cette identification soit faite rapidement et d’une manière précise. Enfin, elle doit être complétée aussi vite que possible par des données sur la sensibilité aux antibiotiques.
En pratique, il est plus important pour un clinicien de savoir rapidement que la bactérie responsable est un bacille à Gram négatif sensible à tel ou tel antibiotique que d’attendre plusieurs jours ou semaines pour avoir une identification précise de cette bactérie. Un des lois primordiales du laboratoire de microbiologie clinique doit donc être la rapidité. Une autre loi, aussi primordiale dans le fond mais secondaire dans le temps, est la précision. Il est évident que les exigences de la biologie clinique ne sont les mêmes que celles de la science taxonomique. Mais il faut que les caractères morphologiques, culturaux, biochimiques, antigéniques qui sont assemblés pour chaque souche bactérienne ou virale permettent de situer l’agent microbien dans la classification microbienne moderne et de lui attribuer un nom précis. S’il n’en est pas ainsi, il n’y a plus de langage commun possible des microbiologistes entre eux et des microbiologistes avec les cliniciens.
Finalement, il faut rappeler que le diagnostic microbiologique ne repose pas uniquement sur une identification directe de l’agent microbien. Il peut reposer sur une identification indirecte : l’agent microbien n’est pas lui-même isolé mais il est caractérisé par les réactions immunologiques spécifiques que sa présence a suscité dans l’organisme. C’est le sérodiagnostic dont on sait qu’il joue un rôle important dans le diagnostic des maladies infectieuses.
Une bonne bactériologie est une bactériologie sûre et il est sage d’étudier les règles de sécurité du laboratoire avant d’entreprendre le moindre travail pratique. Les règles qui suivent méritent une attention spéciale.
1. Quand vous travaillez au laboratoire, portez un tablier de laboratoire propre afin de protéger vos vêtements. Ne portez pas ce tablier en dehors du laboratoire.
2. Ne mettez rien en bouche. Il est potentiellement dangereux de manger, de boire ou de fumer au laboratoire. Pour pipetter, utilisez une poire de caoutchouc(tétine) ou un système mécanique, comme un vide-pipette «pi-pump ». N’aspirez jamais à la bouche. Si nécessaire, utilisez des étiquettes auto-adhésives.
3. Maintenez la paillasse et l’ensemble du laboratoire propre et en ordre.
4. Ecartez tous les déchets contaminés en les plaçant(sans les jeter) dans le récipient approprié.
5. Placez les pipettes, lames porte-objets, etc., contaminées, dans un désinfectant adéquat, actif pendant un temps suffisant, avant de les laver et de les stériliser.
6. Evitez de contaminer le milieu ambiant avec des aérosols contenant des bactéries ou de spores vivantes. Les aérosols sont faits de toutes petites particules(invisibles) de liquide ou de solide, en suspension dans l’air. Ils peuvent se former lorsque des bulles éclatent, quand on ajoute un liquide à un autre ou quand une goutte de liquide tombe sur une surface solide –– choses qui peuvent arriver au cours de bien des manipulations bactériologiques. Les particules de moins de quelques micromètres peuvent rester en suspension dans l’air pendant un certain temps et peuvent être inhalées par les personnes présentes. Il est clair que les aérosols peuvent constituer une source potentielle d’infection. Le travail bactériologique est parfois effectué dans des hottes spéciales (décrites plus loin) –– en partie pour éviter ce risque d’infection par aérosols.
7. Signalez rapidement tout accident et dégât à l’un des instructeurs.
8. Lavez-vous soigneusement les mains avant de quitter le laboratoire.
En règle générale, on doit respecter les étapes suivantes :
a. Les milieux bactériologiques.
b. L’asepsie.
c. Les outils du bactériologiste.
d. Les méthodes d’inoculation.
e. La préparation d’une culture pure à partir d’un mélange d’organismes.
f. L’incubation en anaérobiose.
g. Le comptage des bactéries.
h. La coloration.
II. Le diagnostic microbiologique direct
Le diagnostic microbiologique direct est l’aboutissement d’une suite étapes successives qui sont le prélèvement, le transport du prélèvement et son enregistrement au laboratoire, l’examen microscopique direct d’un frottis du prélèvement et l’isolement proprement dit qui comporte le choix des milieux d’isolement, la méthode d’isolement et la mise à l’étuve, l’identification des colonies isolées et finalement la mesure de la sensibilité aux antibiotiques.
1/ Le prélèvement
Les biopsies et autres prélèvements anatomiques doivent être fait stérilement et placés dans des récipients stériles, à large embouchure, bouchés à vis.
Au laboratoire, les tissus sont finement découpés aux ciseaux puis broyés au mortier stérile avec, le cas échéant, une pincée de sable stérile. Le broyât est ensuite repris par un peu d’eau distillée stérile qui sera utilisée pour l’examen microscopique et la culture.
Les prélèvements de sang pour hémocultures.
Les prélèvements de liquide de séreuses et en particulier de liquide céphalo-rachidien (LCR).
Les prélèvements du naso-pharynx
Les crachats
L’urine
Les prélèvements génitaux
Les prélèvements de selles
Les autres prélèvements sont effectués, selon leur volume et surtout la consistance du produit pathologique, soit à la seringue, soit à l’écouvillon. Dans tous les cas, on se rappellera que les bactéries seront plus faciles à isoler de quelques millilitres de produit pathologique prélevés à la seringue que d’un simple écouvillon qui va très rapidement se dessécher. Enfin, on raccourcira au maximum le délai entre le moment où le prélèvement est fait et celui où il est examiné.
2/ Transport et enregistrement du prélèvement au laboratoire
a. Lorsque le prélèvement n’est pas fait au sein du laboratoire, l’organisation de son transport sans délai au laboratoire est capitale bien qu’elle ne dépende souvent ni de celui qui a fait le prélèvement ni du laboratoire qui le reçoit.
b. Le premier point important est la nécessité d’employer un récipient suffisamment solide et bien bouché pour que le produit pathologique ne puisse s’échapper et contaminer les personnes qui vont le transporter.
c. Le deuxième point concerne l’emploie des milieux de transport. Malgré leur coût, ceux-ci doivent être employés chaque fois que le délai entre le prélèvement et l’ensemencement est trop long.
d. Le troisième point concerne l’étiquetage des prélèvements, les demandes d’analyse biologique ainsi que les renseignements cliniques.
e. Le dernier point concerne la méthode d’enregistrement au laboratoire.
3/ Isolement de la bactérie
L’isolement, plus précisément le primo-isolement ou le primo-culture, de la bactérie responsable est un temps essentiel du diagnostic microbiologique. Il nécessite, outre un prélèvement fait correctement, porté et examiné sans délai au laboratoire :
a. un examen microscopique préalable d’orientation,
b. le choix des milieux de culture(solide) à ensemencer,
c. une méthode d’encensement standardisée ayant pour objectif d’obtenir des colonies isolées,
d. une incubation dans des conditions favorables à la croissance des bactéries recherchées.
4/ Identification de la bactérie
A moins que la bactérie ne soit à l’état pur (cas fréquent des cultures des liquides biologiques), seule la présence de colonies isolées sur milieu de culture solide permet, en pratique, de mener à bien le diagnostic bactériologique.
Le premier temps est celui de l’examen des milieux de cultures ensemencés. Il est recommandé de faire systématiquement un premier examen après 15 à 18 heures d’incubation. Cette manière de faire se justifie par le fait que la plupart des cultures sont positives après ce de lai, qu’il est important pour le clinicien et son malade d’avoir des résultats après 24 heures même se ces résultats sont négatifs.
III. Le diagnostic bactériologique indirect
Le sérodiagnostic d’une infection bactériennconsiste à mettre en évidence les anticorps sériques écifiques du germe responsable et engendrés par le conflit immunologique qui se produit lors de la maladie. Il permet donc le diagnostic indirect d ‘une infection, le diagnostic direct reposant sur l’isolement de la bactérie. dans certains cas, le sérodiagnostic est seul réalisable :
1/ Si le germe responsable ne peut pousser en culture, exemple Treponema pallidum.
2/ S’il est très difficile ou impossible à isoler à cause de son gîte ou de sa présence éphémère dans les produits pathologiques exemple : brusellose à la phase de foyers viscéraux profonds.
3/ S’il a été détruit par un traitement antibiotique institué préalablement aux prélèvements bactériologiques.
4/ S’il s’agit de rechercher rétrospectivement, à la phase de convalescence, l’étiologie d’une maladie infectieuse récente.
La conséquence pratique de cette définition du sérodiagnostic est qu’il convient d’étudier la cinétique du conflit immunitaire, donc la cinétique d’apparition puis de disparition des anticorps sériques. Ceci est réalisé en effectuant au moins deux sérodiagnostics à quinze jours d’intervalle et en conservant les prélèvements de sérum (sérothèque) afin de déterminer rétrospectivement les titres d’anticorps en présence du même antigène. De plus, pour l’interprétation du sérodiagnostic, il faut considérer trois faits importants :
La négativité constante du sérodiagnostic au début de la maladie fait qu’il est souvent d’un appoint diagnostique tardif(il ne devient positif que huit à dix jours après le début clinique) ; dans certains cas, cet examen peut même rester négatif si le conflit antigène-anticorps a été limité dans le temps ou dans son intensité (maladie «décapitée » par les antibiotiques).
Enfin on peut rattacher au diagnostic microbiologique indirect la détection immunochimique des antigènes bactériens. Les méthodes disponibles pour cette détection sont la contre-immunoélectrophorèse, la conglutination, l’agglutination de particules de latex, la méthode ELISA et la méthode radio-immunologique. Les avantages de ces méthodes sont la rapidité, la sensibilité et la possibilité de détecter des antigènes solubles dans les liquides organiques lorsque la culture ou la coloration de Gram sont négatives.
IV. Le prélèvement endocanalaire
Le prélèvement peut avoir un intérêt en endodontie pour mieux adapter les techniques de désinfection.
La mise en culture des prélèvements endodontiques pose de nombreuses difficultés, à cause en particulier des exigences des bactéries anaérobies, et c’est ce qui explique qu’ils ne sont pas de routine en endodontie. Les résultats peuvent aussi être faussés par des erreurs de manipulation au cours du prélèvement. Ainsi, une culture peut montrer des micro-organismes, alors que le système canalaire est stérile, ou révéler la présence de bactéries qui n’appartiennent pas à la flore endocanalaire, mais sont en fait des contaminants issus de la salive, d’une cavité carieuse ; C’est un faux-positif. Ou bien aucun micro-organisme ne sera cultivé alors que le système canalaire est infecté : c’est un faux négatif. L’examen au microscope permet en général de révéler l’existence de faux-positifs ou de faux-négatifs.
Prélèvement transcoronaire
Pour éliminer tout risque d faux-positif, il faut prendre de rigoureuses précautions de stérilité au cours du prélèvement : masques, gants, instruments stériles et surtout digue sont bien sûr indispensables. Avant de pénétrer dans la chambre pulpaire, la dent et la cavité d’accès sont nettoyées à l’eau oxygénée à 30 % d’abord, puis à la teinture d’iode, neutralisée ensuite avec une solution de thiosulfate de sodium. Un prélèvement de contrôle est alors effectué. Après avoir ménagé l’accès à la chambre pulpaire, quelques gouttes de liquide de transport sont déposées à l’entrée du canal pour instrumentation, jusqu’à 1mm de l’apex, en créant des mouvements de pompage. Une pointe de papier (ou plusieurs successivement si nécessaire ) est insérée dans le canal et laissée en place jusqu’à ce qu’elle absorbe tout le liquide. Puis, elle est transférée dans un tube contenant le milieu de transport. On peut penser que c’est la dernière pointe qui récoltera les bactéries de l’apex ou des parois.
Pour éliminer tout risque de faux négatif, on doit prendre des précautions, en particulier pour assurer la survie des bactéries anaérobies strictes. La quasi-impossibilité de ménager une chambre opératoire en conditions d’anaérobiose oblige à effectuer le prélèvement aussi rapidement que possible dès l’ouverture de la chambre pulpaire.
Prélèvement périapical
Le prélèvement dans une fistule requiert une désinfection de la muqueuse sur 1 cm autour de l’entrée de la fistule.
En l’absence de fistule, le prélèvement de pus se fera après incision, sur un coton mise en culture ou mieux, à la seringue qui permet de bien conserver les conditions d’anaérobiose. Quand une résection apicale est indiquée, on prélève les tissus infectés apex, granulome, kyste, os.
V. Tests de sensibilité utiles au traitement antibiotique
Le laboratoire de bactériologie dispose de nombreux tests de sensibilité des bactéries vis à vis des molécules d’antibiotiques, en particulier celles inscrits dans la nomenclature nationale.
Ces tests permettent de détecter des résistances bactériennes et d’aider ainsi le médecin praticien dans sa prescription.
Tests de sensibilité
La sensibilité d’une bactérie est mesurée par la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l’antibiotique considéré. C’est la méthode de référence préconisée par l’OMS. Cette CMI est la plus petite quantité d’antibiotique capable d’inhiber une croissance visible à l’œil nu. La CMI d’un germe donné peut être mesurée par différents procédés de laboratoire :
1/ CMI en milieu liquide
* Principe
On repartit dans une série de tubes à hémolyse un volume constant de bouillon nutritif, qu’on ensemence avec un inoculum fixe de bactéries environ 106 / ml Puis on ajoute à ces tubes des quantités croissantes de l’antibiotique à étudier (0,25 – 0,5 – 1 – 2 – 4 – 8 – 16 – 32 g / ml). Un tube témoin est laissé sans antibiotique. Après une nuit d’incubation à 37o C les tubes sont soigneusement examinés.
* Interpretation
Le tube témoin sans antibiotique est uniformément trouble.
Le premier tube de la série demeurée limpide indique précisément la CMI.
2/ CMI en milieu solide
* Principe
On repartit aux même doses croissantes d’antibiotiques dans des tubes de gélose en fusion et ramené à 40o C environ. Puis chaque tube avec sa propre dose d’antibiotique, est coulé dans une boite de pétri où la gélose va se solidifier. Il est alors possible d’ensemencer sur cette série de boite plusieurs souches microbiennes différentes sous la forme de stries parallèles.
* Interprétation
La CNI sera donnée par la première des concentrations d’antibiotique qui supprime sur la gélose toute culture apparente.
La CMI est comparée aux concentrations critiques qui permettent de classer les souches, pour l’espèce bactérienne étudiée et l’antibiotique testé, dans la catégorie clinique : sensible, résistance ou intermédiaire.
Ces concentrations critiques résultent de nombreuses études pharmacologiques, statistiques et cliniques.
Elles reflètent pour chaque antibiotique, les concentrations sanguines obtenues in vivo par administration d’une dose utilisable en thérapeutique
Exemple : Streptococcus A : CMI critique de l’Ampicilline ; 0,01 – 4 g / ml
La comparaison de la CMI de l’antibiotique à ces concentrations critiques permet donc de classer la bactérie testée dans catégorie :
-sensible : la CMI est plus petite que la concentration critique minimale obtenue en thérapeutique.
La souche peut être atteinte par traitement à dose habituelle par voie générale.
-résistante : la CMI est plus grande que la concentration critique maximale pouvant être, atteintes in vivo sans dépasser le seuil toxique.
La souche ne pourra probablement pas être éliminée, quelles que soient les modalités du traitement.
-intermédiaire : la CMI est comprise entre les deux concentrations critiques.
La souche pourrait être atteintpar un traitement local, de fortes doses par voies générales.
3/ Mesure de la CMI par diffusion de disque en gélose (antibiogramme)
C’est la méthode utilisée en pratique courante, car c’est la plus aisée, bien que parfois d’interprétation difficile.
* Principe
Cette technique utilise des disques de papier buvard imprégnés d’une concentration donnée d’antibiotique déposé à la surface d’une gélose spécifique (Muller Hinton) coulée en boite de pétri ensemencée d ‘une suspension (106 bactéries / ml) de la bactérie étudiée.
* Interprétation
Après une nuit à 37oC, il s’établit un gradient de concentration de l’antibiotique. L’interaction entre la bactérie et l’antibiotique s’exprime par une zone d’inhibition dont le diamètre est une expression indirecte de la CMI. Grâce à des études comparatives portant sur un grand nombre de souches appartenant à des espèces bactériennes différentes, des droites de régression liant pour un antibiotique donné les CMI aux diamètres d’inhibition correspondants ont été tracées.
Elle servira au médecin traitant soit :
à choisir un antibiotique pour traiter une infection donnée.
à rectifier un traitement de premier intention inadapté.
La liste des antibiotiques testés au laboratoire est choisie en fonction du germe et du site infectieux.